职称医学论文发表参考一篇:归肾丸治疗多囊卵巢综合征的网络药理学作用机制

  职称医学论文发表参考一篇:归肾丸治疗多囊卵巢综合征的网络药理学作用机制

  陆岩1,王小云(2

  510120)

  1.

  广州中医药大学第二临床医学院,广东广州510405;2.广东省中医院,广东广州

  摘要:目的通过网络药理学研究方法和分子对接技术预测归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的作用机制。方法利用TCMSP数据库,收集归肾丸有效成分并预测其作用靶标,通过GeneCards与OMIM数据库筛选出多囊卵巢综合征的靶标,运用R软件获取疾病交集靶标,绘制韦恩图。运用Cytoscape软件构建归肾丸治疗多囊卵巢综合征的“药物-成分-靶标-疾病”网络,通过STRING数据库构建靶标蛋白相关作用网络并进行关键靶标的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。通过Autodock Vina软件对药物有效成分与疾病靶标进行分子对接验证。结果筛选得到归肾丸治疗多囊卵巢综合征的78个有效成分和78个药物-疾病共同靶标,并推断其作用机制可能与介导PI3K-Akt、HIF-1及TNF等124条信号通路相关。槲皮素、山柰酚、豆甾醇等有效成分与PTGS1、ESR1、PGR等靶标对接结果良好。结论归肾丸有效成分可能通过抗炎性反应、改善胰岛素抵抗、促进卵泡发育、控制血糖稳态、调节脂质代谢、调节激素水平等药理作用来治疗多囊卵巢综合征。

  关键词:归肾丸;多囊卵巢综合征;作用机制;网络药理学;分子对接

  中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1003-9783(2021)06-0825-09

  doi:10.19378/j.issn.1003-9783.2021.06.011

  The Network Pharmacological Mechanism of Guishen Pills in the Treatment of Polycystic Ovary Syndrome

  LU Yan1,WANG Xiaoyun2(1.The Second Clinical School of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405 Guangdong,China;2.Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine,Guangzhou 510120 Guangdong,China)

  Abstract:Objective To predict the mechanism of Guishen pills in the treatment of polycystic ovary syndrome

  (PCOS)through network pharmacology method and molecular docking technology.Methods The TCMSP database was used to collect the active ingredients of Guishen pills and their targets were predicted.The targets of PCOS were screened out through GeneCards and OMIM databases,and R software was used to obtain targets intersection.Then,a Venn diagram was drawn.Cytoscape software was applied to construct the“drug-component-target-disease”network of Guishen pills for the treatment of PCOS.We constructed the target protein interaction network through the STRING database and performed the GO function enrichment analysis of key targets and the KEGG pathway enrichment analysis.Autodock Vina software was used to verify the interaction between the active ingredients of the drug and the disease target.Results 78 active ingredients and 78 drug-disease common targets of Guishen pills in the treatment of PCOS were screened,and its mechanism of action was inferred to be related to mediating 124 signaling pathways such as PI3K-Akt,HIF-1 and TNF,etc..Effective ingredients(quercetin,kaempferol and stigmasterol)have good docking results with targets(PTGS1,ESR1 and PGR).Conclusion The active ingredients of Guishen pills may treat PCOS through anti-inflammatory response,improvement of insulin

  收稿日期:2020-10-09

  作者简介:陆岩,女,博士研究生,研究方向:中西医结合妇产科学。Email:ly1104421721 163.com。通信作者:王小云,女,主任医师、教授,研究方向:中西医结合妇产科学。Email:tcm1104 126.com。

  基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1704102);国家中医药管理局王小云全国名老中医药专家传承工作室项目(国中医药人教发[2016]42号);广东省中医院中医二院[2013]233号岭南中医妇科流派工作室项目;广东省科技计划项目(2017B030314166);广东省自然科学基金项目(2018A030310508)。

  resistance,promotion of follicular development,control of blood glucose homeostasis,regulation of lipid metabolism,and regulation of hormone levels.

  Keywords:Guishen pills;polycystic ovary syndrome;mechanism of action;network pharmacology;molecular docking

  多囊卵巢综合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)是常见的妇科内分泌疾病,以排卵障碍、多囊卵巢、高雄激素临床表现和/或高雄激素血症为主要特征[1]。目前其发病机制尚无确切定论,可能与遗传、环境、心理等因素相关,发病率为5%~10%并呈现升高态势[2]。多囊卵巢综合征可导致育龄期女性生殖功能障碍,远期合并代谢性相关疾病、心血管疾病、雌激素依赖性肿瘤等风险增加[3]。治疗方式多以口服避孕药为主,然而有数据表明服用口服避孕药的多囊卵巢综合征患者深静脉血栓风险明显升高[3]。中医药治疗多囊卵巢综合征具有疗效好,安全性高等优势[5]。其中归肾丸是治疗多囊卵巢综合征疗效明确的经典方,多项研究表明归肾丸具有降低多囊卵巢综合征患者促黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)与雄激素水平,促进排卵,提高妊娠率等作用[6-8]。

  归肾丸出自《景岳全书》,由熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、茯苓、当归、杜仲和菟丝子8味药物组成,具有补益肝肾、健脾益气、养血填精的作用。现代研究[9-11]发现归肾丸具有降低大鼠体内LH水平,提高雌二醇(Estradiol,E2)水平,改善病理状态下大鼠卵巢的结构和功能,抑制颗粒细胞凋亡,清除氧自由基,延缓衰老等作用。

  网络药理学通过系统层面揭示中药对机体调控网络的作用,将网络数据库中的数据整合并通过计算机软件等构建药物化合物成分与疾病蛋白间的相互作用图,阐释两者间的关联性,为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[12]。而归肾丸治疗多囊卵巢综合征的具体机制尚无明确定论,本文运用网络药理学及分子对接技术预测其中可能的机制。

  1材料与方法

  1.1归肾丸有效成分的筛选在中药系统药理学分析平台(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php/)检索,获取归肾丸中熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、茯苓、当归、杜仲和菟丝子等8位药物的有效成分。

  因中药多为口服制剂,故以药代动力学参数为依据,设置药物口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%,药物相似度(Drug-likeness,DL)≥0.18,筛选出有效成分。

  1.2归肾丸有效成分作用靶标的筛选通过TCMSP数据库进行“靶标预测”。再利用perl软件(http://www.perl.org/)对收集的化学成分及作用靶标标注基因名称。

  1.3归肾丸治疗多囊卵巢综合征关键靶标的获取GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)是一个分析人类基因数据的综合数据库;在线“人类孟德尔遗传”数据库(OMIM,Online Mendelian Inheritance in Man,https://omim.org/)记录了所有已知疾病的遗传成分,并可以预测它们与人类基因组中的相关基因的关系。在GeneCards与OMIM数据库中检索“Polycystic Ovarian Syndrome”获取相关靶标,去除重复部分。运用R软件(https://www.rproject.org/)对归肾丸有效成分相关靶标和疾病靶标取交集,绘制韦恩图(Venn),获得的靶标即为归肾丸治疗多囊卵巢综合征的关键靶标。

  1.4“药物-有效成分-靶标-疾病”网络的构建使用Cytoscape 3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)构建“药物-有效成分-靶标-疾病”关系网络。通过该网络可以深入分析归肾丸治疗多囊卵巢综合征可能的作用机制。以网络节点度值(Degree)和介度中心性

  (Betweenness Centrality,BC)为筛选条件,挖掘网络重要组成。

  1.5靶标蛋白相互作用的网络构建将归肾丸治疗多囊卵巢综合征的关键靶标导入STRING数据库

  (https://string-db.org)进行检索,选择“Multiple Proteins”功能,选择“物种”为人类(Homo Sapiens),设定置信度评分>0.40,从而构建PPI

  (Protein-Protein Interaction)网络。将PPI网络的靶标导入Cytoscape软件,利用CytoNCA对靶标的BC、接近中心性(Closeness Centrality,CC)、Degree、特征向量中心性(Eigenvector Centrality,EC)等条件进行中位数过滤,循环两次筛选出每个条件均高于

  中位值的靶标。

  1.6GO功能富集分析与KEGG通路富集分析先用perl软件将归肾丸治疗多囊卵巢综合征的关键靶标名称转换成entrez ID,然后进入Bioconducto(r http://www.bioconductor.org/)找到R软件。Bioconductor是目前最常用的高通量基因组数据分析工具之一,它以R软件为平台提供了19个物种(含人类)的GO(Gene Ontology)注释信息。结合entrez ID,设置P<0.05,得到GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

  1.7分子对接根据网络构建的拓扑结果,用分子对接模拟研究配体在复杂分子网络中的潜在相互作用。从RCSB PDB数据库(Protein Data Bank,http://www.rcsb.org/)检索PPI网络中核心靶标的3D结构PDB格式文件,去除水分子、加氢后使用Autodock

  Tool 4.2(ADT)保存为Pdbqt格式。从ZINC数据库

  (http://zinc.docking.org)下载网络图中核心成分的Mol2格式文件。采用Autodock Vina进行核心成分与核心靶标间的分子对接验证。以结合能评估分子与靶标的结合能力,结合能<0 kcal·mol-1表明能自发结合,结合能≤-5 kcal·mol-1表明结合良好。

  2结果

  2.1归肾丸有效成分筛选的结果通过检索TCMSP数据库,设置OB≥30%,DL≥0.18为参数,得到归肾丸有效成分共139个,其中熟地黄2个、山药16个、枸杞子45个、山茱萸20个、茯苓15个、当归2个、杜仲28个和菟丝子11个。表1展示了归肾丸中多个药物共有的有效成分。

  表1归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)部分有效成分信息表

  Table 1 Information table of some active ingredients of Guishen pills in the treatment of PCOS

  序号分子ID

  1 MOL000098

  2 MOL001495

  3 MOL000449

  4 MOL000358

  5 MOL001494

  6 MOL000359

  7 MOL000422

  8 MOL005438

  9 MOL005440

  化学名称

  quercetin ethyl linolenate

  stigmasterol beta-sitosterol mandenol sitosterol kaempferol campesterol isofucosterol

  中文名称

  槲皮素

  亚麻酸乙酯豆甾醇

  β-谷甾醇

  十八碳-6,9-二烯酸乙酯谷甾醇

  山柰酚菜油甾醇

  异岩藻甾醇

  口服生物利用度(OB)/%46.43

  46.10

  43.83

  36.91

  42.00

  36.91

  41.88

  37.58

  43.78

  药物相似度(DL)

  0.28

  0.20

  0.76

  0.75

  0.19

  0.75

  0.24

  0.71

  0.76

  来源中药菟丝子、杜仲、枸杞子山茱萸、枸杞子

  熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、当归枸杞子、山茱萸、当归、杜仲、菟丝子山茱萸、枸杞子

  熟地黄、山茱萸杜仲、菟丝子枸杞子、山药山药、菟丝子

  2.2归肾丸有效成分治疗多囊卵巢综合征的潜在作用靶标筛选的结果排除重复靶标后获得归肾丸有效成分作用靶标119个。Gene Cards及OMIM数据库筛选多囊卵巢综合征相关靶标3 114个。运行R软件“VennDiagram”程序包将归肾丸有效成分相关靶标与多囊卵巢综合征相关靶标取交集,获得归肾丸有效成分治疗多囊卵巢综合征的潜在作用靶标,绘制韦恩图(图1)。

  2.3“药物-有效成分-靶标-疾病”网络的构建

  归肾丸

  PCOS

  Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-有效成分-靶标-疾

  病”相互作用的网络图(图2)。该网络由158个节点

  组成,包括药物节点1个、成分节点78个、靶标节

  点78个及疾病节点1个。

  网络节点Degree和BC反映了网络中节点核心度的高低,Degree越高,表明该节点越重要。将Degree值和BC值按大小排序筛选核心成分和靶标,结果显示,quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰

  图1归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)有效成分相关靶标与多囊卵巢综合征相关靶标交集韦恩图

  Figure 1 Venn diagram of intersecting PCOS targets and related targets of active ingredients in Guishen pill

  酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、stigmasterol(豆甾醇)、isorhamnetin(异鼠李素)、beta-carotene(β-胡萝卜素)等归肾丸有效成分以及NCOA2(核受体共激活

  注:红色代表疾病,绿色代表药物,紫色代表归肾丸有效成分,蓝色代表作用靶标

  图2归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的“药物-有效成分-靶标-疾病”图

  Figure 2 The"drug-active ingredient-target-disease"diagram of Guishen pill in the treatment of PCOS

  因子-2)、PGR(孕激素受体)、NR3C2(核受体亚家族C组成员2)、PTGS1(前列腺素G/H合酶和环氧合酶)、CHRM3(毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3)、PPARG

  (过氧化物酶体增生激活受体γ)等作用靶标是网络的

  表2归肾丸-成分-靶标-多囊卵巢综合征(PCOS)网络关键节点

  Table 2 Key nodes of Guishen pills-ingredients-targets-PCOS network

  重要组成(表2)。

  序号化学名称

  1 quercetin

  槲皮素

  中文名称

  类型度值

  成分336

  介度中心性

  0.184 4

  2.4归肾丸治疗多囊卵巢综合征关键靶标的PPI网络进入STRING数据库,输入归肾丸有效成分治疗多囊卵巢综合征的靶标,设定置信度评分>0.40,得到归肾丸有效成分对应的靶标PPI网络(图3)。将PPI网络靶标导入Cytoscape软件,利用CytoNCA进行二次中位数筛选(图4、表3),其中IL-6(白细胞介素6)、CCND1(G1/S-特异性周期蛋白D1)、ESR1(雌激素受体1)、CAV1(微囊蛋白1)、FOS(核蛋白转录因

  子)、MAPK8(丝裂原活化蛋白激酶8)、MYC(癌基

  2

  beta-sitosterol

  3kaempferol

  4stigmasterol

  5isorhamnetin

  6beta-carotene

  7NCOA2

  8PGR

  9NR3C2

  10PTGS1

  11CHRM3

  β-谷甾醇成分88

  山柰酚成分84

  豆甾醇成分64

  异鼠李素成分26

  β-胡萝卜素成分16

  核受体共激活因子-2靶标48

  孕激素受体靶标48

  核受体亚家族C组成员2靶标28前列腺素G/H合酶和环氧合酶靶标28毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3靶标18

  0.016 0

  0.042 5

  0.007 9

  0.016 7

  0.008 3

  0.103 1

  0.101 2

  0.038 2

  0.034 5

  0.015 6

  12PPARG过氧化物酶体增生激活受体γ靶标15 0.005 2

  图3归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)关键靶标的PPI网络

  Figure 3 The PPI network of Guishen pills in the treatment of PCOS key targets

  图4归肾丸治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的PPI核心靶标

  Figure 4 PPI key targets of Guishen pills in the treatment of PCOS

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